목차
1. G2 체크포인트
2. 실험 준비
3. 샘플 고정(Fixation)
4. 샘플 준비
G2 체크포인트는 DNA 손상 시 세포의 유사분열을 차단하며, 암세포는 이 체크포인트를 비활성화하여 유전체 불안정성을 초래합니다. DNA 결합 염료를 이용해 DNA 양을 측정할 수 있으며, 히스톤 H3의 Ser10에서 인산화는 유사분열 세포를 표시합니다. 이를 통해 Anti-Histone H3 pSer10 항체, propidium iodine, 그리고 flow cytometry를 이용한 유사분열 세포의 정량화와 DNA 함량 분석 방법을 소개합니다.
G2 체크포인트
G2 체크포인트는 DNA가 손상될 경우, 세포가 유사분열(mitosis)에 진입하는 것을 차단하고, 유전체의 완전성(genome integrity)을 보호하는 역할을 합니다. 암세포는 이러한 G2 체크포인트를 비활성화하여 유전체의 불안정성을 초래하는 변이를 가지고 있습니다. DNA 결합 염료는 DNA의 양에 비례하여 염색하는데, 이는 DNA의 양이 많을수록 더 많은 염료와 결합하기 때문입니다. 예를 들어, S phase에 있는 세포가 G1 phase에 있는 세포보다 많은 DNA를 가지므로, 이는 S phase 세포가 더 많은 염료와 결합하여 DNA 함량이 두 배가 될 때까지 더 밝게 빛나게 합니다. 마찬가지로, G2 phase의 세포는 G1 phase의 세포보다 약 두 배 더 밝게 빛날 것입니다. Propidium iodine (핵산 염색)을 사용하면 4N DNA 함량을 가진 세포 일부를 확인할 수 있습니다. 그러나, 4N 세포 중 얼마나 많은 비율이 DNA 합성을 방금 마친 것인지, 또 실제로 얼마나 많은 비율이 유사분열 중인지는 파악할 수 없습니다. 히스톤 H3은 핵심 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3, H4) 중 하나로, 뉴클레오솜에서 DNA를 랩핑 합니다. 히스톤 H3의 Ser10에서 인산화는 염색체 응축과 깊은 관련이 있습니다. 따라서, 히스톤 H3 pSer10 신호는 응축된 DNA를 가진 유사분열 세포를 나타냅니다. 이번 글에서는 Anti-Histone H3 pSer10 항체, propidium iodine, 그리고 flow cytometry를 이용한 유사분열 세포의 정량화와 DNA 함량 분석 방법을 소개하겠습니다.
실험 준비
2개의 6 cm 플레이트에 세포를 이식하여 다음 날에는 confluence가 90% 정도 되도록 합니다 (Day 1). 그다음 날, confluence가 90% 정도 되는 6 cm 플레이트에서 세포를 1:5로 희석하여 6개의 6 cm 플레이트에 confluence가 40% 정도 되게 이식합니다 (Day 2). 그 다음 날, 준비된 3개의 6 cm 플레이트는 그대로 두고, 나머지 3개의 6 cm 플레이트에는 DNA 손상 처리를 합니다 (Day 3).
| Day | Activity |
| Day 1 | 2개의 6 cm 플레이트에 세포를 이식하여 confluence가 90% 정도 되도록 함 |
| Day 2 | Confluence가 90% 정도 되는 6 cm 플레이트에서 세포를 1:5로 희석하여 6개의 6 cm 플레이트에 confluence가 40% 정도 되도록 이식 |
| Day 3 | 준비된 3개의 6 cm 플레이트는 그대로 두고, 나머지 3개의 6 cm 플레이트에는 DNA 손상 처리를 함 |
샘플 고정(Fixation)
DNA 손상 처리 후 3시간이 지나면 6개의 6cm 플레이트 배지(각각 3ml)를 15ml 튜브에 모읍니다. 배지 플레이트는 1ml 1x PBS로 세척하고, 세척한 PBS도 이전에 사용한 15ml 튜브에 모읍니다. 그다음, 0.5ml trypsin을 6cm 플레이트에 넣고 37°C에서 5분 동안 처리합니다. 5분 후에는 플레이트에 1ml 배지를 넣고 기존의 15ml 튜브에 세포를 모읍니다. 이어서, 1,200 rpm으로 2분 30초 동안 원심 분리한 후, 조심스럽게 배지를 제거하고 펠릿만 남깁니다. 펠릿에 1ml PBS를 추가한 다음, -21°C에서 보관했던 9ml 메탄올을 15ml 튜브에 넣습니다(총 부피는 10ml). 이 15ml 튜브는 실험을 시작할 때까지 -20°C에 보관합니다.
샘플 준비
샘플을 고정한 후 실온에서 10분 동안 방치하고, 원심분리(1,600 rpm, 2분)합니다. 그런 다음 메탄올을 제거하고 펠렛만 남깁니다. 1ml PBS를 사용하여 펠렛을 1.5ml 튜브로 옮긴 후, 원심분리(5,600 rpm, 1분 30초)하고 PBS를 제거합니다. Anti-Histone H3 pSer 10 항체를 Ab 희석 버퍼(3% BSA, 0.05% Tween 20, 0.04% sodium azide in PBS)에 1:500 비율로 희석하고, 각 튜브에 200 µl를 넣어 37°C에서 1시간 동안 회전시키며 처리합니다. 조심스럽게 항체를 제거하고 1ml PBS를 추가하여 세척합니다. 5,600 rpm으로 1분 30초 돌려서 펠렛만 남기고 PBS를 제거합니다. 2차 안티바디 (Alexa Fluor 488)를 Ab 희석 버퍼로 1:200 비율로 희석하고, 이를 200 µl 넣어서 37°C에서 30분 동안 보관합니다. 1차 때와 같은 방법으로 안티바디를 제거한 후, PBS로 워싱하고 펠렛만 남깁니다. 이후, 400 µl의 DNA labeling 솔루션(RNase, propidium iodine, 1X PBS)을 추가하고 37°C에서 10분 동안 처리합니다. 마지막으로 처리한 400 µl를 필터 튜브로 옮기면 Flow cytometer 분석을 위한 준비가 완료됩니다. Propidium iodine은 DNA 뿐만 아니라 RNA에 결합하기 때문에 DNA labeling 솔루션의 RNase가 RNA를 제거해서 배경을 감소시킵니다.
