바이러스 벡터는 재조합되기 쉽습니다.
렌티바이러스 (lentiviral) 벡터에서 재조합 (recombination)은 종종 장말단 반복(LTR) 사이에서 발생합니다. 재조합 후, 하나의 플라스미드는 관심 있는 형질전환 유전자(일명 바이러스 게놈)를 가지고 있고 또 다른 플라스미드는 박테리아 선택 마커와 복제 원점을 포함합니다.
박테리아 배양 동안 항생제 내성 유전자와 원점을 가진 플라스미드만 복제되고 형질전환 유전자는 손실됩니다. 시간이 지남에 따라 재조합된 벡터 백본을 포함하는 박테리아는 전체 길이의 플라스미드를 포함하는 박테리아보다 더 자랄 것입니다.
샘플의 재조합을 어떻게 방지할 수 있나요?
플라스미드 재조합은 바이러스 벡터(LTR 및 ITR), 다중 폴리 A 부위가 있는 플라스미드 및 반복되는 요소가 포함된 다른 플라스미드에 영향을 미칠 수 있습니다. 재조합이 일어나기 쉬운 플라스미드를 증폭하는 방법을 알고 준비하면 골치 아픈 일을 피할 수 있습니다.
1. 올바른 균주를 선택하세요
DH5-alpha와 같은 일반적인 E. coli 균주는 recA- 이지만, 일부 균주는 재조합을 더욱 줄이기 위해 조작되었습니다. Stbl2, Stbl3 및 NEB 안정 E. coli와 같은 재조합효소 결핍 균주는 샘플에서 재조합률을 감소시킵니다.
2. 성장 조건 최적화
재조합을 줄이려면 37°C에서 플라스미드를 과도하게 증식시키지 않는 것이 중요합니다. 일부 연구자들은 30°C 배양 온도를 사용하여 박테리아를 더 느리게 증식시키면 재조합 위험을 줄이는 데 도움이 된다는 것을 발견했습니다.
벡터가 크거나(>10kb) 복제 수가 적은 경우, 더 긴 성장 기간(최대 24시간)을 사용하거나, 항생제 농도를 줄이거나(예: 100μg/mL Amp 대신 50μg/mL Amp) 또는 더 영양이 풍부한 배지를 사용하면 성장과 DNA 수율을 개선할 수 있습니다.
3. 여러 개의 작은 콜로니를 테스트
LB agar 플레이트를 스트리킹 한 후 크고 작은 콜로니가 모두 있는 것을 알 수 있습니다. 재조합된 제품을 포함하는 박테리아는 더 빨리 자라는 경향이 있으므로 전체 플라스미드를 운반할 가능성이 더 높은 작은 콜로니를 선택하는 것이 좋습니다.
글리세롤 스톡을 저장하기 전에 여러 콜로니를 테스트하여 선택한 콜로니에 전체 플라스미드가 포함되어 있는지 확인하십시오
재조합 벡터 백본과 전체 길이 플라스미드에 대해 다른 밴드 패턴을 제공하는 제한 효소를 선택하십시오. 박테리아 배양물에 전체 길이 플라스미드와 재조합 벡터 백본이 혼합되어 있는 경우 단일 콜로니에 대해 다시 스트리킹 하고 여러 가지 준비를 테스트해 볼 수 있습니다.
[출처]
https://blog.addgene.org/preventing-viral-plasmid-recombination
