Immunohistochemistry (IHC)는 특정 항체를 사용하여 조직 샘플에서 특정 항원을 측정하는 실험법입니다. IHC는 암 조직의 병리학적 평가, 종양의 예후 예측, 치료에 대한 반응 예측, 감염 유무 확인 등 수많은 연구 분야에서 적용됩니다.
IHC 실험을 위한 샘플 준비
조직은 파라핀 포매 (paraffin embedding) 또는 냉동보존(cryooreservation, freezing)을 통해 준비 및 보존됩니다. 종종 보존 방법은 고정 유형 (type of fixation)과 밀접하게 연관됩니다. 포르말린 고정 조직 (Formalin-fixed tisseus)은 일반적으로 고정 후 파라핀 포매하는 반면, 냉동 조직 절편은 냉동보존 후 알코올로 고정합니다. 각 방법에는 뚜렷한 장단점이 있습니다. 파라핀 포매는 형태학적 세부 사항을 더 잘 보존하는 것으로 여겨지는 반면, 냉동보존은 효소 및 항원 발현 (antigen expression)을 더 잘 보존하는 것으로 여겨집니다. 각 실험에 대한 최적의 방법은 항원의 특성, 세포 내 위치, 원하는 검출 방법 등을 고려하여 결정해야 합니다.
| 파라핀 포매 조직 | 냉동 조직 | |
| Fixation | Embedding 전에 | 절편 후 |
| Sectioning | 마이크로톰 | Cryostat |
| 저장 | 장기, 실온에서 수년간 보관 가능 | 단기, -80 °C에서 1년 |
| 장점 | 조직 형태를 보존합니다 | 효소 및 항원 기능 보존 |
| 제한 사항 | 과도한 고정은 에피토프 (epitope)를 가릴 수 있습니다. | 얼음 결정 형성은 조직 구조에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. |
파라핀 포매 조직
파라핀 포매하기 전에 조직을 고정해야 합니까?
조직을 장기간 보존하는 가장 좋은 방법은 파라핀 포매입니다. 포매하기 전에 조직을 고정제에 즉시 관류하거나 담그는 것이 조직 파괴를 방지하고 보존을 보장하는 데 필요합니다.
조직을 포매하기 전에 얼마나 오랫동안 고정해야 합니까?
최상의 결과를 얻으려면 조직을 4~24시간 동안 고정합니다. 24시간 이상 조직을 고정하면 과고정이 발생하여 항원이 가려지고 IHC 염색에서 항체-에피토프 결합이 제한될 수 있습니다.
파라핀 포매 전에 조직을 탈수해야 합니까?
파라핀과 물이 섞이지 않기 때문에 용융 파라핀 왁스를 첨가하기 전에 조직을 탈수해야 합니다. 조직을 알코올 농도가 증가하는 곳에 담그면 알코올이 조직에 침투하고 물이 알코올로 대체됩니다. 알코올은 탈수를 통해 조직을 수축시키고 단단하게 만들기 때문에 침지 시간을 면밀히 모니터링해야 합니다. 탈수 후 크실렌에 담그면 과도하거나 남아 있는 알코올이 제거되고 조직을 포매할 준비가 됩니다.
파라핀은 어떤 온도까지 가열해야 하나요?
일반적으로 파라핀은 포매를 위해 60°C로 가열한 다음 조직에 첨가한 후 밤새도록 굳게 둡니다.
파라핀 포매 조직을 실온에 보관할 수 있나요?
파라핀 블록에 포매된 조직이나 슬라이드에 있는 파라핀 포매 조직 절편은 실온에서 보관할 수 있습니다.
냉동 조직
조직 샘플을 어떻게 냉동해야 합니까?
동결 조직은 이소펜탄이나 액체 질소에 조직을 담가서 준비합니다. 급속 동결은 조직을 동결하는 데에도 사용됩니다.
냉동보존 중에 샘플을 언제 수정해야 합니까?
냉동보존 및 조직 절편 후 슬라이드를 냉동고에서 꺼내 실온에서 따뜻하게 합니다. 그런 다음 슬라이드를 고정제(보통 알코올이나 아세톤)에 담급니다.
냉동 조직에 항원 회수 단계를 실행해야 합니까?
알코올 고정은 포름알데히드를 사용하여 조직을 고정할 때 필요한 에피토프 회수의 필요성을 피합니다. 알코올 고정은 가교를 생성하지 않으므로 항원 회수가 필요하지 않습니다.
냉동 티슈는 어떻게 보관해야 하나요?
냉동 조직 절편은 최대 1년 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
인산화를 연구하려면 냉동 조직이나 파라핀 포매 조직을 사용해야 합니까?
번역 (translational) 후 변형과 같이 빠르게 악화되기 쉬운 매우 민감한 단백질은 급속 동결로 더 잘 보존할 수 있습니다. 포르말린 고정은 번역 후 변형된 단백질의 발현을 변경할 수 있습니다.
파라핀 포매 조직이 냉동 조직보다 더 나은가?
이는 실험 세부 사항에 따라 달라집니다. 포르말린 고정 파라핀 포매 조직은 실온에서 장기간 보관할 수 있는 반면, 냉동 조직은 -80°C에서 최대 1년까지만 보관할 수 있습니다.
냉동 조직은 얼음 결정 형성의 영향을 받을 수 있으며, 이는 세포 내 세부 사항에 영향을 미치고 IHC 염색에 영향을 미칠 수 있습니다.
냉동 조직의 또 다른 잠재적인 단점은 절편의 두께입니다. 파라핀 포매 절편과 비교할 때, 냉동 조직은 더 두껍기 때문에 미세한 분해능과 조직 형태를 세부적으로 포착하는 능력이 떨어집니다. 그러나 동결 보존은 항원과 항원성을 더 잘 보존하는 것으로 생각됩니다. 냉동 조직은 번역 후 변형 단백질 (post-translationally modified protein), DNA 또는 RNA 연구도 권장됩니다.
[출처]
https://www.novusbio.com/sample-preparation-for-ihc-experiments
